2018年10月21日日曜日

もしも生体成分分析専用HPLCがあったら1

HPLCとは高速液体クロマトグラフィー High performance liquid chromatographyのことです。バイオ分析では、生体中代謝物を抽出してサンプルを作ります。HPLCはサンプル中の個々の代謝物の分離を担当します。代謝物を分離すると、個々の代謝物の定量が容易になります。HPLCでは、個体の粒子(固相)を詰めたカラム(管)に、溶媒(液相)に溶けた試料を流します。すると、固相との相互作用の弱い化合物は早くカラムから流出し、相互作用の強い化合物は遅くカラムから流出します。これにより、化合物を分離することができます。HPLCが今後もバイオ分析の中核を担う分離技術であることは明らかです。ので、もし、生体成分分析専用HPLCがあったら、妄想してみました。

1.なにはともあれバイオイナート

HPLCは液相が触れる部分はおおよそ
・ステンレス鋼材(SUS)の部品、配管
・ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)の配管
でできています。このうち、ステンレス鋼材にはアニオン性の化合物が吸着し、ピーク形状が悪化する原因になるといわれています。アニオン性の化合物はバイオ分析のもっとも大事な測定対象が多く含まれています。
現状のHPLCはバイオ分析用に作られているとは全く言えません。
PEEKにもいろいろくっつくようですが、なにはともあれステンレス鋼材(SUS)を流路から排除する必要があります。また、ステンレス鋼材から金属イオンが溶け出す(水は最強の溶媒)とも言われており、溶け出した金属イオンが、アニオン性の化合物と相互作用したり、イオン化抑制を起こしたりするといわれています。

となると、ステンレス鋼材を使わず、生物不活性(バイオイナート)素材でHPLCシステムを構成することが、バイオ分析の第一歩になります。これには、

1.バイオイナートのHPLC装置、セミミクロ、ミクロ、ナノスケール
2.バイオイナート素材のカラム、トラップカラム、プレカラム、カラムホルダー
3.バイオイナート素材のバルブ。セミミクロ、ミクロ、ナノスケール用
4.LC-ESI-MSではESIイオン源のスプレーニードル
5.メタルフリーの水、メタノール、アセトニトリル、ギ酸、

が必要です。

1.については、すでにバイオイナート化されたセミミクロスケール用のHPLCが、国産だと島津製作所をはじめ、各社から市販されています。SUSをセラミック、チタンやPEEKに変更した装置です。ただ、バイオ分析の主戦場となると思われる、ミクロスケールの装置たなると、まだまだこれから、という状況です。ナノスケールはAMRさんとかに聞くといろいろありそう。
2.カラム管の内壁をガラスコートしたバイオイナートカラムもSGECERIなどから、セミミクロスケール+C18の組み合わせで、出始めています。どうもフリット部分がむつかしいようです。今後は、ミクロ、ナノスケール用のカラムでもバイオイナート化が進み、さらに、トラップカラム、プレカラム、カラムホルダーがでてくると完璧ですね。また、CERIさんカラムの管に、このメーカーの固相を詰めたい!などのわがままなユーザー向けのカラム充填サービスが登場すると嬉しいです。
3.もバイオイナートバルブがアジレントからが出しています。探せはいろいろありそうです。
4.SUSに接する部分を極力減らしたものが、ABSciex用に市販されております。作ることはできるようなので、各社出そろうといいですね。
これらの対策のご利益はCERIさんがテクニカルレポートとしてまとめておられ、やはり、ピーク形状の改善に効果があるみたいです。

とりあえず、バイオイナート化をすすめましょう




2018年10月1日月曜日

ロキ古細菌

ここしばらく、アーキアの代謝がマイブームである。真核生物は、アーキアの細胞内に原核生物が共生して、20億年前までには成立したらしい。水素仮説によれば、アーキアのユーリ古細菌門に属するメタン菌(嫌気条件下でメタンを生成しつつ、二酸化炭素と水素から有機物を合成可能)とαプロテオバクテリア(酸素が乏しい環境では発酵によって生き続け、水素と二酸化炭素と酢酸塩を細胞外に排出する)がお互いの排出物を利用しあう相利共生関係を持ち、さらにそれが細胞内共生へと発展したと考えられる。実際有機酸酸化細菌と、メタン菌との共生関係がよく観察されることから、有力な説とされている。一方、真核生物とアーキアが持ち、原核生物が持たない分子メカニズム(アクチン様タンパク、低分子量GTPアーゼなど)に注目し、真核によく似たアーキアを探す試みが最近活発化している。これまでに、ユーリ古細菌とはべつのクレン古細菌のほうが、類似点が多いことが明らかになり、これ以上は培養可能な菌からは見つかりそうにないので、メタゲノム解析データから、ゲノムを再構成するというアプローチがとられている。2015年の論文では、北極海のロキの丘と呼ばれる熱水噴出孔の付近から採取された培養できないアーキアの5,381の遺伝子を含むゲノムがメタゲノム解析から再構築された (Kegg organismにはLokiarchaeum sp. GC14_75としてすでに収録されている)。解析の結果、従来知られているアーキアとは大きく異なること(そこでロキ古細菌門を新たに作った)、系統樹解析からアーキアの中で最も真核生物に似ていることが示された。また、2016にはこの生物が水素に依存しているらしいというか、メタン菌に必要な遺伝子を持つらしいことが報告され、水素仮説と整合があることからも、真核生物とアーキアの間を埋める生物である可能性が取りざたされている。ちなみにKEGGによるとLokiarchaeum sp. GC14_75の再構成ゲノム中には、グルコースから乳酸に至る解糖系が通っているなど代謝屋としても注目ポイントが高い。
この領域はメタゲノム解析+ゲノム再構築という技術をてこに、これからも多くの発見があるだろう。たとえば最近になって、より真核生物に近いとされる「ヘイムダル古細菌」がみつかったりしている。
が、はたしてこの方法できちんとしたゲノムが再構成されているのかについては疑問が多い。例えば、2017年の論文では、Lokiarchaeum sp. GC14_75のゲノムデータで系統樹解析をやり直している。すると、EF2という遺伝子のデータを抜いたら、Lokiarchaeum sp. GC14_75はユーリ古細菌に属するという結果になった、メタゲノム中のアーティファクトによく注意した再検討が必要だろう。と、報告されている。
たしかに、
  • 真核生物の成立は進化の過程で1回しかなかったらしいが、メタン生成菌とバクテリアの共生は現在でも見られる、1回しか起きなかった理由がうまく説明できない。
  • 真核生物にはメタン生成に必要なheterodisulfide reductaseの遺伝子を持つ生物はいないようだ。
というあたりで、メタン生産菌を念頭に置いた水素仮説そのものも再検討が必要だろう。いずれにせよこれらのアーキアの代謝特性が、現在の真核生物の代謝とどのように関連しているのかにはものすごく興味があります。

2018年7月18日水曜日

第161回 質量分析関西談話会プログラム


161回 質量分析関西談話会プログラム
「四重極について学ぶ」

201884日(土) 1500分~1800

島津製作所関西支社マルチホール (会場定員60名)
大阪市北区芝田1-1-4
大阪梅田 阪急ターミナルビル14
JR大阪駅ホーム北側に隣接するビルです。阪急17番街のエレベータで14階までお越しください。)
電話06-6373-6522

四重極質量分析装置は最も広く普及しています。人生ではじめてつきあった質量分析装置が四重極という方は多くおられると思います。また、特に薬物動態分野の歴史は液体クロマトグラフ/トリプル四重極質量分析装置の発展とともにあり、多くの分析屋の相棒として活躍してきた四重極質量分析装置ですが、その原理や、発展の歴史、開発者の思いなどを知る機会は限られています。そこで、今回の関西談話会では、四重極質量分析装置に焦点を当て、原理や、発展の歴史、開発者のみなさまからお話を伺う機会としたいと思います。多くの方のご来聴を歓迎します。


講演プログラム:
15:0015:50:石原盛男氏(大阪大学大学院理学研究科)
「四重極型質量分析装置のしくみ(仮)」
15:5016:40:窪田雅之氏(サーモフィッシャーサイエンティフィック):
「トリプル四重極質量分析装置の歴史」
休憩
17:0018:00:御石浩三氏(島津製作所)
「四重極質量分析装置の開発」

参加費:
無料
講演終了後、簡単な懇親会を予定しております。懇親会に参加される方は当日会場にてお志を集めさせていただきます。

参加申込み:
参加希望の方は、(1)氏名、(2)所属、(3)メールアドレス、(4)日本質量分析学会
会員/非会員の別を添えて、下記メールアドレスにお申し込みください。
kansai17_%_mssj.jp (送信の際は、_%_@に変えてください)
関西談話会世話人代表 松田史生(大阪大学)


世話人:川畑 慎一郎(島津製作所)、黒野 定 (和光純薬工業)、豊田岐聡 (大阪大学)、松田 史生 (世話人代表、大阪大学)

2018年6月13日水曜日

mfapyインストール方法

mfapyインストール方法


180613

mfapyとはpythonベースの13C-MFAデータ解析用ツールボックスです。大阪大学大学院情報科学研究科バイオ情報計測学講座で開発を進めています。OpenMebius[論文] のPython番という位置づけで2012年ころより開発を開始しましたが、Toolbox化することで大幅に機能を拡張したため、互換性は全くなく、コードベースも別になっています。

変更点

ver 0.5.0
・pyfluxもfluxpyもpymfaもすべて使われていたため、mfapyになりました。
・python3に変更しました。さらにAnacondaの使用を推奨としました。
・python3に対応しないpyOptをあきらめnloptにソルバーを変更しました。また、有効な大域最適化法が見つかりました。
・1スレッドと並列実行のコマンドを統合しました。mfypy.metabolicmodel.MetabolicModel.fitting_flux()など。
・G-indexに対応するため、モデル定義ファイルを拡張しました。
・反応の制約に"pseudo"を追加しました。化学両論行列(フラックス)の計算では無視するが、アトムマッピングでは考慮する反応です。これでG-indexが使えます。
・set_configure => set_configuration などコマンド名を修正しました。
・GitHubにて公開しました。
ver 0.5.1
・炭素数10以上の中間体に対応しました。これにあわせてモデル定義ファイル//Target_fragmentsのフラグメントの表記がGluc_12345からGlu_1:2:3:4:5に変更になりました。付け焼刃感たっぷりです。
ver 0.5.2
・mfapy.mdv.correct_natural_isotope()
・mfapy.mdv.add_natural_isotope()
を追加しました。モデル定義ファイル//Target_fragmentsの5列目に組成式を記述すると、それをもとに、天然同位体比の補正(足す、除く)をやってくれます。
また、試験的に
・mfapy.metabolicmodel.MetabolicModel.set_configuration()

・add_naturalisotope_in_calmdv = "yes"
とすると、MDVの計算時に天然同位体比のを足す補正をしてくれるようにしました。MS/MSデータは未対応なのでご注意を。

注意点

・まだバグがありそうなので、見つけ次第報告お願いします。

入手

https://github.com/fumiomatsuda/mfapy
からダウンロードしてください。

インストール

1. windowsのユーザー名(フォルダ名)は1 byteアルファベット、スペースなしであることが無用なエラーを防ぐ。
× 松田
× Fumio Matsuda
〇 FumioMatsuda
この例ではFumioMatsuda

2. これまでのpythonをすべてアンインストール

3. mfapyを例えば
C:\Users\FumioMatsuda\mfapy
に置く

4. Anacondaをダウンロード
https://anaconda.org/
の右上のDownload Anacondaをクリック。Sign Upは不要
Python3.6 version, 64 bit versionの最新版をダウンロード

5. デフォルトのままインストール

6. スタートメニューのAnaconda3(64-bit)=>Anaconda Promptを起動
(base) C:\Users\FumioMatsuda>
というコマンドプロンプトが出る。
(base)は現在の環境名
C:\Users\FumioMatsuda>は現在参照しているフォルダのパス
> dir
でフォルダの中のファイルのリストが見れる。
> cd mfapy
でmfapyフォルダに移動可能
> cd..
で一つ上のフォルダに移動

7. 仮想環境をmfapyを構築する。
> conda create -n mfapy python=3.6 numpy scipy matplotlib=2.1
質問されたら y でお返事

8. 仮想環境mfapyをactivateする。
> conda activate mfapy
(mfapy) C:\Users\FumioMatsuda>
環境名がmfapyになる。

9. 他のパッケージをインストールする(この順番が大事)
> conda install -c conda-forge nlopt
> conda install -c anaconda mkl-service 

10. Parallel pythonをインストールする
https://www.parallelpython.com/content/view/18/32/
に行き、
Download pp-1.6.4.4.zip
をダウンロード(バージョン注意1.6.4.4限定)。解凍後
C:\Users\FumioMatsuda\mfapy\
にフォルダを移動する。
現在参照しているフォルダをpp-1.6.4.4にする
cd mfapy
cd pp-1.6.4.4
(mfapy) C:\Users\FumioMatsuda\mfapy\pp-1.6.4.4>
となるはず。
> python setup.py install

11. mfapyをインストールする
現在参照しているフォルダをmfapyにする
(mfapy) C:\Users\FumioMatsuda\mfapy>
> python setup.py install

12. unittestを行う。
続いて
> python setup.py test
と入力、なにやらでてきてエラーなしでOKと出ればインストール成功

13 PyScripter をインストール
https://sourceforge.net/projects/pyscripter/
64bit (x64)用のv3.4.1以降をダウンロード
 /PyScripter-v3.4/PyScripter-v3.4.1-x64-Setup.exe
をデフォルトでインストール
3.4.1以降で仮想環境に対応した(えらい) 

12 PyScripter を起動、仮想環境を設定
メニューのRunの一番下から2番目Python Versions=>Setup Python
"+"ボタンを押し、
C:\Users\FumioMatsuda\Anaconda3\envs\mfapy
選ぶ。Unresigtered versionに
Python 3.6 (64bit) C:\Users\FumioMatsuda\Anaconda3\envs\mfapy
が追加されるので、選択して左上の歯車ボタン。緑の矢印で選択される。

13 動作のテスト

C:\Users\FumioMatsuda\mfapy\script\
にExampleがあるので、これがすべて動くかを確かめる。 
このファイルをもとに使い方を勉強する。

質問など

コードの追加、修正案、バグのレポートは松田まで。
 特にEMU構築のあたりが泥沼になっているので、リフォームが必要

Todo

  • スキャンデータからのMDV取得
  • 天然同位体比除去
  • バグがないかの確認


2018年5月4日金曜日

Rでオイラー法を解く


#one reaction
step_num <- 10000
dt <- 0.001
S_initial <- 100
P_initial <- 0
k1 <- 1
S <- numeric(step_num+1)
P <- numeric(step_num+1)
t <- numeric(step_num+1)
S[1] <- S_initial
P[1] <- P_initial
t[1] <- 0
for (i in 1:step_num){
  S[i+1] <- S[i] - k1 * S[i] *dt
  P[i+1] <- P[i] + k1 * S[i] *dt
  t[i+1] <- t[i] + dt
}
plot(t, S, ylim =c(0,120))
points(t, P, col="red")

2018年4月8日日曜日

ZWF

グルコース6リン酸を酸化して6-ホスホグルコン酸に変換する酵素タンパク質(グルコース6リン酸脱水素酵素, glucose 6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)をコードする遺伝子記号は、伝統的にZWFあるいはzwfなどと表記されます。他の酵素遺伝子の記号は、pgi = phosphoglucoisomerase, hxk = Hexokinaseのように反応名の略称の場合が多いのでふしぎだなと思っていたのですが、とある総説が答えを教えてくれました。

Stincone et al. The return of metabolism: biochemistry and physiology of the pentose phosphate pathway.Biol Rev Camb Philos Soc. 2015 Aug;90(3):927-63.

がん代謝のワールブルグ効果で有名なドイツのOtto Warburgが1935年ころの一連の論文で電子運搬体としてNADH, NADPHが存在すること、グルコース6リン酸を酸化して6-ホスホグルコン酸に変換する酵素はNADP+を電子受容体として要求すること、酵母からこの酵素を精製してZwischenferment ('intermediate enzyme'という意味らしい)と名付けたことが由来だそうです。
あと、この論文のタイトルかっこいいですな。。スターウォーズの初期3部作の最後ジェダイの帰還”Return of the Jedi”の引用なのかしらと思って調べてみたら、そもそもがトールキンの指輪物語3部作の最後”The Return of the King”の引用で(中学校で読んだぞ、懐かしい)、たぶんこれも何かの引用なんでしょうか、、あとこの総説が3部作になっているの??

2018年3月29日木曜日

林業的バイオプロダクション

バイオプロダクション、というのは植物が光合成で固定した炭素(バイオマス)を微生物の代謝能力で有用な化合物、例えば燃料やプラスチック原料に変換しよう。というものです。工学的な発想だと、でかい石油化学コンビナートの原料を石油からバイオマスに、触媒を微生物に変換したらいいじゃん。と考えます。この工業的バイオプロダクションがバイオプロダクション技術の背景にある基本思想といっていいでしょう。地下から湧き出て輸送効率がいい石油が原料なら、一か所にでかい設備を作るのが正解ですが、問題は、バイオマスというのは地理的に薄く広がった資源である。ということと、再生可能とはいえ、再生には時間がかかるということ、軽くて運搬するエネルギーがもったいないということと、バイオマスの運搬=土地から栄養素を奪うことにつながることだと思います。
工業的なバイオプロダクションがあるなら、農業的なバイオプロダクションというのもありじゃんと思います。けど、特に食料自給率の低い日本のような国では食べ物を作れる土地があるなら食べ物を作ったほうがいいですよね。
となると、残るは林業的バイオプロダクションです。そもそも、石炭石油の時代が来るまでは、山から切って来た木で燃料をまかない、いまならプラスチックで作るようなものもみな、木や竹を加工して作っていたのです。植物が光合成で固定した炭素(バイオマス)を微生物変換抜きで直接使っていたといえるでしょう。ただ、木を資源として復活させるには、切ってきて山の下まで運ぶのがとっても大変だというむつかしい問題があります。植物の光合成とは、光エネルギーを還元力(電気)あるいは化学エネルギーに変換し(光反応)、ついでそれらを利用して炭素を固定します。炭素として固定されちゃうと運ぶのが大変なので、
・林道沿いの木の樹冠に安価な太陽電池パネル(シート)をかぶせる感じでドローンで敷設する。太陽電池パネルからは電線で電気を集める(できれば太陽電池パネル(シート)と電線は生分解性のものがよい。10年くらいでだめになり、そのうち土に返ってほしい)。木が光合成に使う光エネルギーを一部電気として使わせてもらう。
・それから植物で発電ができる可能性があるらしい。山全体でやればいいじゃん。
・発電した電気は中山間地のエネルギーとして利用する。
・あまった電気は、エコひーぽんみたいな小型プラントに送りこむ。その中では電極から受けとった電子で炭素固定ができる微生物が炭素固定を行い、プラスチック原料へと変換する=微生物蓄電とする。
・固定したプラスチック原料がある程度たまったら、回収して地方中核都市にある工業的バイオプロダクション施設に売り払う。
・山の中に住んでるやつが、最後は勝つ。
という林業的なバイオプロダクションは、ありえませんかね。