もしも生体成分分析専用HPLCがあったら４

バイオ分析では、細胞内の内因性代謝中間体の同定と、定量を目指します。内因性代謝中間体の特徴は、親水性が高い点です。アミンだったり有機酸だったりと溶液中でイオン化するアニオン性やカチオン性化合物のオンパレードであります。もともとHPLCに使うカラムは親水性相互作用を使った、順相系のものが使われていましたが、耐久性、再現性に問題を抱えていたそうです。一方、LC-MSの発展を強力に推し進めた薬物動態分野では、薬物や薬物代謝物など、比較的疎水性の高い化合物が分析対象だったこともあり、オクタドデシルシリル基(ODS)でシリカゲル表面を修飾した逆相系のカラムが好んで利用され、塩基性薬剤をシャープに分離できるカラムの開発競争が起きて、ものすごく高性能なカラムが現在市販されるようになりました。また、逆相系は高い耐久性、再現性があり、分析屋さんもこよなくODSカラムを愛してきました。一方、内因性代謝中間体は、逆相系のカラムで分離するには、疎水性が低すぎました。そこで、10年ほど前から、逆逆相とか、HILICという順相っぽいカラムが登場しています。が、どこかのシンポジウムで、「昔あんなに順相がイヤで、逆相に移行したのに、いまさらまた、順相を引っ張り出してくるってどういうこと？」というコメントを聞いたことがありますが、それくらい、逆相系への信頼があつい。のだと思います。

また、内因性代謝中間体には構造異性体が多く、ロイシンとイソロイシンとか、グルコース 6-リン酸、グルコース 1-リン酸とフルクトース 6-リン酸などの糖リン酸ように構造はそっくり。しかも重要な代謝物なので、しっかりと分離しないと分析として使い物にならない。という課題があります。そこで、HILICカラムを使って分離を試みても、標準化合物混合物ではうまく分離できたが、実試料ではピーク形状の悪化がおき、うまく分離できない。と事態が起きます。そうすると、HILICカラムの抱える耐久性、再現性の問題点に対してそれほどメリットがない。ということで、大きなブレークスルーには至っていません。

次に、逆相系カラムをいじって、内因性代謝中間体を保持できないか。というアイデアが出てきます。特にペンタプルオロフェニルペンチル(PFPP）基を導入したカラムで、内因性代謝中間体、特にアミノ酸が保持、分離できる。というのは大きな発見でした（確か味の素の方が12年くらい前に発見されたと思います）。フッ素が5個結合したベンゼン環とカチオン性内因性代謝中間体がどのように相互作用しているのかは謎ですが（π―π相互作用？）、そこそこの堅牢性のあるこのカラムの利用は着実に広がっており、今後のバイオ分析を支える重要技術となっていくと期待されます。あとは、PFPPカラムの需要が高まり、開発競争が起きて、どんどん性能が良くなる。という、勝ちパターンにつながるといいなぁとおもいます。

次なるアイデアとして、ODSに親水性の官能基を導入し、疎水性相互作用と、親水性相互作用の両方で化合物を分離するミックスモードといわれるカラムが開発されました。京都の雄、インタクトが販売しているアミノ酸分析用のカラムは、ロイシンとイソロイシンをばっちり分離し、LC-MSにもつなげるカラムとして、ミックスモードの可能性を示しています。一方、どの官能基をどういうふうに導入すると、糖リン酸をうまく分離できるのかはまだ、わかっていないようです。世のクロマトグラファーの挑戦が待たれます。

次に、移動相をいじることで、内因性代謝中間体の保持、分離の向上を狙うドーピング系のアプローチもあります。たとえは、移動相にEDTAを添加すると、サンプル中、カラム表面の金属イオンとキレートを形成するため、アニオン性の化合物のピーク形状が一気に改善した。というエーザイの小田さんらの報告は(Myint et al. Anal Chem 81(18):7766-7772)、まだまだ、改善の余地があることを示した。ということで画期的でした。ただ、EDTAの添加はLC-MSとの相性が良くありません。同様のアプローチとして、揮発性のacetylacetoneをキレート剤に用いる方法も出てきていますが（Siegel et al. J Chromatogr A 1294:87-97 )効果が微妙なようです。

さらに、メタノール／水／酢酸系に、トリブチルアミンをイオンペア剤として追加し、ODSカラムを使ってアニオン性の糖リン酸を分離する。という手法も登場しました。この方法は、グルコース 6-リン酸、グルコース 1-リン酸とフルクトース 6-リン酸をしっかり分離できるわけではないが、実試料を分析した時の破綻が少ない。ATP、ADP等の多価のアニモンも同時分析可能。ODSカラムの堅牢性を生かせる。等のメリットがある一方、トリブチルアミンは一度使うと洗浄できないので、他のメソッドとの共存がむつかしいという強烈な欠点もあります。われわれは、糖リン酸が測れないとお話にならない。という点と、ラボに古くなって使われなくなった、他の手法との共存を考えなくていいトリプル四重極のLC-MSがたまたまあった。という理由で、トリブチルアミンを使った方法をつかっていますが、だれにでもお勧めできるというものではありません。

また、糖リン酸を抽出後、化学的に誘導体化して分析する。というアプローチもあります。調べた限り、この方法とHPLCでの分離を組み合わせた例はないようですが（あったら教えて、、、）、最近われわれは、糖リン酸類を化学的に誘導体化後、「ガスクロマトグラフィー」で分離できることを示しました。GCやるな。とおもいます。

いずれにせよ、細胞内の内因性代謝中間体を気分よく、分離する技術はまだまだ発展途上です。最近は、薬物動態分野に向けた開発が一段落したようなので、これからは、バイオ分析に注力したカラムの開発、分離法の開発が進むことが期待されます。