GFP発現酵母株を作るかなり簡単な方法

出芽酵母に蛍光タンパク(GFP)を発現させたかったのです。そこでもっとも簡便な方法はなにかなといろいろ調べてみたところ、岡山大学の守屋先生のホームページで「Gap-Repair Cloning」法を発見したので試してみました。Gap-Repair Cloning法とは出芽酵母が「組み換え修復機構（一般には相同組み換え）」活性を持つ事を利用して、25bp以上の相同領域を持たせたDNA断片をそのまま酵母に導入し、酵母細胞内で断片を結合させてプラスミドを構築する手法です。今回行ったのは

１．pGK426（2ミクロン型の複成開始点およびURA3マーカーを持つプラスミドベクター、神戸大学の石井先生作成）をSalI, EcoRIで切断し、念のため電気泳動後に精製したもの。1.5時間もあれば作成可能。
２．pUA66 (GFP遺伝子をコードしている)を鋳型としてGFP遺伝子のORF部分をPCRで増幅したPCR反応液。その際、PGK1プロモーターの3'末端領域およびPGK1ターミネーターの5'末端領域の50bpがそれぞれ、GFP遺伝子の上流と下流に付与されるようにプライマーを設計した。今回は念のため50bpの重複領域を設定したが25bpくらいまで減らせる（＝コスト削減）らしい。4時間もあれば作成可能。
３．その日のうちに（１）と（２）をそのまま酵母YPH499株に酢酸リチウム法で形質転換、選抜培地にまく。
４．3日後には大量のコロニーが得られた。
５．5コロニーを選んでコロニーＰＣＲを行ったところPGK1プロモーターとPGK1ターミネーターの間にGFP遺伝子が挿入された事を示すバンドが５株とも観察された。

６．コロニーをかき取って顕微鏡で観察したところ、GFPの蛍光が見られた。

白黒写真でもうしわけありません。

大腸菌を一切使わず、シーケンスのチェックもヌキではありますが作り始めて3日後にはできました。またすごく形質転換効率が高くておどろきました。
Gap-Repair Cloning法の利点と欠点は守屋先生のページにて議論されております。出芽酵母のこういう便利な特性を活用するとあっとおどろく事ができるかもしれませんね。